啤酒微生物检验技术

　　1.1无菌室

　　1.1.1无菌室标准

　　无菌度：10000级；温度：20℃－25℃；湿度：＜60%；压力：0.5Pa，正压，＜1.5Pa。

　　1.1.2无菌室管理

　　（1）微生物操作人员必须具有严格的无菌意识；

　　（2）操作人员要换上无菌室专用的工作服、鞋、帽、口罩，经风淋门进入；

　　（3）无菌室内始终保持正压，防止外界空气进入；

　　（4）外人不得进入无菌室，不用的物品应及时拿出；

　　（5）定期开紫外灯杀菌，休假日，紫外灯不关；

　　（6）每周做一次空间卫生检查；

　　（7）每天工作之前和结束后，清扫无菌室。

　　1.1.3培养基

　　1.1.3.1培养基类型

　　（1）麦汁琼脂培养基：检出酵母；

　　（2）营养琼脂培养基：检出一般细菌；

　　（3）NBB（NBB－A、NBB－B、NBB－C）培养基：检查啤酒有害菌。

　　1.1.3.2培养方法

　　（1）一般细菌使用营养琼脂培养基，培养温度37℃，有氧培养24小时；

　　（2）酵母使用麦汁琼脂培养基，培养温度25℃－28℃，有氧培养48小时；

　　（3）厌氧菌使用NBB培养基，培养温度25℃－28℃，厌氧平板培养5天－7天，或液体培养1星期－2星期。

　　1.1.3.3结果鉴定

　　（1）镜检：液体培养基中观察混浊沉淀的产生，固体培养基上观察菌落的形成；

　　（2）产酸情况的观察：若细菌产酸，则培养基的pH值在培养后会发生变化；

　　（3）闻气味：有些有害菌的代谢产物具有特殊气味，可根据培养后的气味帮助鉴定；

　　（4）革兰氏染色：用KOH实验法判定菌落的革兰氏阳性和阴性；

　　（5）过氧化氢酶实验：将纯菌落涂到干燥的载玻片上，滴一滴3%过氧化氢液，好氧菌和兼性好氧菌含有过氧化氢酶，能分解过氧化氢：

　　过氧化氢酶

　　2H2O2————→2H2O＋O2

　　逸出的氧气形成气泡，显示对过氧化氢酶实验阳性；厌氧菌和兼性厌氧菌不能起反应，为过氧化氢酶实验阴性。

　　1.1.4对大肠杆菌的检测：大肠杆菌对啤酒厂来说是最严重的污染元素，因此，日常检测非常重要。下面，就是我公司的检测步骤：

　　1.1.4.1设备和材料

　　温箱：36±1℃；水浴：44±0.5℃；天平；显微镜；均质器或乳体；温度计；平皿；试管；吸管；载玻片。

　　1.1.4.2培养基及乳体

　　乳糖胆盐发酵管；伊红美蓝发酵管；乳糖发酵管；蛋白胨水；革兰氏染色液；靛基质试剂。

　　1.1.4.3大肠菌群检验程序（表1）

　　1.1.4.4操作步骤

　　（1）检样稀释

　　①以无菌操作将检样25mL（或25g）放于含有225mL灭菌生理盐水，或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），或灭菌乳钵内，经充分震荡或研磨，做成1∶10的均匀稀释液。②用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。

　　③另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。

　　④根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。

　　（2）乳糖发酵实验

　　将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及以下者，用单料乳糖发酵管。每一稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如果所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

　　（3）分离培养

　　将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18h—24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。

　　（4）证实实验

　　在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1个—2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。

　　（5）报告

　　根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数。

　　1.2加强微生物检测操作人员的培训

　　（1）强化微生物检测人员的无菌意识；

　　（2）提高微生物检测人员的操作技能；

　　（3）微生物检测人员一定要注意个人卫生；

　　（4）个人物品不准随便放于无菌室内；

　　（5）上班后，立即更换工作服，不穿工作服不准进入无菌室；

　　（6）取样要准确，确保取样过程的无菌操作；

　　（7）加强无菌操作，杜绝因操作有误引起的菌检不合格；

　　（8）严格执行无菌室的杀菌程序，定期开紫外灯杀菌；

　　（9）加强学习，充分利用当前先进的检测技术，争取在最短检测时间内通知车间。

　　1.3加强对取样瓶和培养皿的卫生管理

　　（1）定期对取样瓶和培养皿蒸汽杀菌，要求温度在120℃，时间≥30分钟；

　　（2）用完后，取样瓶和培养皿须及时刷洗，以备杀菌再用；

　　（3）超过20天的取样瓶和培养皿，不能再取样使用，必须重新杀菌后再用；

　　（4）杀菌后的取样瓶和培养皿保存好，杜绝二次污染。

　　1.4取样

　　保证无菌操作。

　　1.4.1取样阀应具备条件

　　（1）无杀菌死角，保证无菌状态；

　　（2）压缩空气的取样阀应设置在过滤器后直接通往使用区的管路上，每一分管可以反映各自的无菌

　　状态；

　　（3）管路尽可能缩短；

　　（4）高度应距地面1.2m－1.5m，有利于取样的无菌操作。

　　1.4.2取样方法

　　先用酒精喷灯灼烧取样口，放掉一部分样液（防止因取样口温度较高，取出的样品细菌数比实际少），再用酒精喷灯封口，在无菌状态下快速用无菌瓶取样。

　　1.5啤酒病害微生物

　　1.5.1啤酒有害菌对产品的不良影响

　　（1）产生异味；

　　（2）引起混浊和沉淀；

　　（3）黏度提高；

　　（4）压力升高。

　　1.5.2野生酵母（表2）

　　指不为啤酒正常生产所用，在啤酒酿造过程中，易引起不正常发酵或产生病害的异种酵母。

　　1.5.3细菌（表3）

　　分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

　　2微生物污染途径（表4）

　　3啤酒生产过程中的检测点（表5）

　　4制麦的卫生管理

　　4.1微生物对大麦的影响

　　在田间侵染大麦的微生物被称为“田间真菌”。麦穗刚从叶梢中露出就受到各种微生物的侵染，潮湿阴雨的天气会增加大麦受污染的程度，生长后期倒伏也会使微生物大量生长，因此，无论是购买进口大麦还是国产大麦，都要把大麦的生长天气考虑进去。

　　4.2微生物对仓储大麦的影响

　　污染储藏大麦的菌群主要是曲霉菌和青霉菌，其主要来源：一是田间感染；二是收获和储存过程中感染。因此，大麦的储存条件，基本上就决定了这些微生物能否在大麦上进一步生长。其中，含水量和温度很重要，含水量在13%以下，安全温度为15℃，通常以7℃－9℃为好。4.3微生物对制麦过程的影响

　　大麦在制麦时的浸麦度达到43%－48%，发芽温度12℃－18℃，该条件有利于微生物的繁殖。

　　4.4制麦微生物对啤酒质量的影响

　　大麦和麦芽微生物的影响是贯穿啤酒生产始终的。制麦时微生物过多，会抑制大麦的发芽，使麦芽溶解不良、增加色度、产生不良异味。同时在啤酒生产中，降低了啤酒的气体稳定性，可引起啤酒的喷涌。关于啤酒喷涌的原因，目前发现主要是由于大麦和麦芽受到微生物的污染而引起的，如交链孢霉、黄曲霉等。此外，污染微生物还能影响胶体的稳定性。